規範環境下(xià)色譜積分(fēn)的(de)合&•理(lǐ)合規性控制(zhì)

為(wèi)确保對(duì)色譜峰進行(xíng)正确的(de)測量★↓★φ（或積分(fēn)），需要(yào)分(fēn)析∞α人(rén)員(yuán)對(duì)積分(fēn✔∑∏®)結果進行(xíng)準确性和(hé)一(yī)緻性判斷。在大(dà)多(duε✔δ₽ō)數(shù)情況下(xià)，人(rén)為(wè♣™→i)參與的(de)過程往往會(huì)導緻判斷結果受到(dào)非客λγ¥∏觀标準的(de)影(yǐng)響。所以色譜積分(fēn)的(de)合理(lǐ★φ£)合規性尤為(wèi)重要(yào)，這(zhè)也(yě)是(shì)監管γ★×₩機(jī)構的(de)審查重點，這(zh♥€÷è)篇文(wén)章(zhāng)我們将簡要(yà₩ o)討(tǎo)論如(rú)何對(duì)色譜積分(‌₹≤αfēn)進行(xíng)合理(lǐ)合規性控制(zhì)。

1 簡介

高(gāo)效液相(xiàng)色譜（HPLC）和(hé)氣ε♣♠相(xiàng)色譜（GC）是(shì)現(x♣↔​→iàn)代分(fēn)析實驗室中最常用(yòng)的(de)技(jì)術(s™Ωhù)。這(zhè)兩種技(jì)術(shù)的(de)專屬性、靈敏度和(hé€→§‌)靈活性使其适用(yòng)于廣泛的(de)樣品基≤€®質中絕大(dà)多(duō)數(shù)被分(fē$≥n)析物(wù)的(de)測定。這(zhè)兩種技(•≈ $jì)術(shù)的(de)原始輸出都(dōu)是(shì)信号強®§<度對(duì)比時(shí)間(jiān)的(de)曲&↑÷ 線圖，通(tōng)常稱為(wèi)色譜圖。色¥₩ '譜圖中的(de)各個(gè)峰分(fēn)别對(duì)應于樣品​• ↑中的(de)各個(gè)成分(fēn)，而峰面積通(tōng)常正比于樣ε↓™♣品中相(xiàng)應成分(fēn)的(de)濃度。

要(yào)定量樣品中的(de)被分(fēn)析物(wù)濃度，就(j★∞​iù)需要(yào)對(duì)色譜圖進行(xíng)積分(≠®fēn)以測量峰的(de)面積。現(xiàn)代高(gāo)效液相(xiàn₽✔✔g)色譜法和(hé)氣相(xiàng)色譜儀配備的(de)電(diàn)腦(‌♣nǎo)色譜數(shù)據采集和(hé)處理←∞(lǐ)系統，都(dōu)具備自(zì)動化(huà)積分(f™×λ‍ēn)的(de)功能(néng)，分(fēn)析β↔人(rén)員(yuán)需要(yào)做α↔​€(zuò)的(de)主要(yào)是(sh♣←≈&ì)設定适當的(de)積分(fēn)參數(shù)（例如(rú)：斜率靈£ε★λ敏度，噪聲阈值，峰寬阈值，峰面積的(de)阈值，峰高(gā♦σ¥ o)阈值，撇去(qù)率等），軟件(jiàn)将依據這(zhè)些(xiē)參₽σδ♠數(shù)來(lái)對(duì)各個(gè) λ£ 色譜峰進行(xíng)确認和(hé)積分(fēΩ♥n)。

2 監管要(yào)求

由于分(fēn)析人(rén)員(yuán)可>∏(kě)以根據自(zì)己的(de)主觀判斷人'<£(rén)為(wèi)地(dì)設定積分(fēn)參數(<↕ €shù)，無論在常規審查或藥品生(shēng)産上(shà$★​©ng)市(shì)授權評估過程中，對(d↓λ<uì)色譜峰正确和(hé)精确的(de)積分(fēn)∏↔及其過程都(dōu)是(shì)重點審核內(nèi)容。

從(cóng)美(měi)國(guó)FDA對(duì)藥企α↔¥•發布的(de)警告信中，可(kě)以看(kàn)到(d>γβ∏ào)關于色譜積分(fēn)的(de)一(yī)些(xiē)更加具體( ©tǐ)化(huà)的(de)要(yào)求：↕≥≥"

• 不(bù)允許采用(yòng)手動積分(fēn)。

• 需要(yào)開(kāi)啓色譜軟件(jiàn↑₹)的(de)審計(jì)跟蹤功能(néng)，并将包含積分(fēn)參♥★數(shù)的(de)分(fēn)析方法和(hé)原始數≈‌ ♥(shù)據一(yī)同保存，以确保方法的(de)積分(fēn‌€≤Ω)參數(shù)修改曆史可(kě)追溯。

• “更改積分(fēn)參數(shù)，以得(de)到(d∑∏←ào)好(hǎo)的(de)積分(fēn)結果”是(shì)不(bù)可(k€★ě)接受的(de)。在審查過程中，沒有(yǒ× ≈u)合理(lǐ)解釋的(de)多(duō)次重新積分(fēnπ←↓')被認為(wèi)是(shì)企圖人(rén)為(wèi)操縱峰面積以獲✔‍得(de)合格的(de)結果。

• 方法一(yī)旦經過驗證且被用(yòng∏Ω)于藥品的(de)常規QC放(fàng)行(xíng)< ，對(duì)後續每個(gè)色譜數(shα"λ•ù)據的(de)積分(fēn)都(dōu)需要(∑≥∑®yào)使用(yòng)該方法以确保一(yī)緻性。FDA當前的(de)÷>‍≈期望實際上(shàng)是(shì)傾向于将色譜方法“鎖定”以保證始λ↕©∞終使用(yòng)同樣的(de)積分(fēn)參數←π↔÷(shù)。

綜合來(lái)講，色譜峰的(de)積分(fēn)、積分(fēn)參數(sh​§↕ù)的(de)設定和(hé)驗證、積分(fēn)參數(shù)的(de)&₽±修改和(hé)再驗證等都(dōu)要(yào)遵循科γ$(kē)學合理(lǐ)的(de)過程，并通(t>↑≥∏ōng)過标準操作(zuò)規程（SOP）或類似的(de)文(wén)件(¶₩₩jiàn)進行(xíng)控制(zhì)。

3 控制(zhì)色譜積分(fēn)的(de)♥∏₽>合理(lǐ)合規性

那(nà)麽，要(yào)怎樣控制(zhβ∏πì)色譜積分(fēn)的(de)合理(lǐ)合規性呢(ne)？我們分(↓≠fēn)以下(xià)幾個(gè)小(xiǎo)節來±₽¥(lái)探討(tǎo)。

3.1 通(tōng)用(yòng)積分(f∞¶§✘ēn)過程及參數(shù)

為(wèi)了(le)對(duì)積分(fēn)參數(shΩδù)進行(xíng)設定，有(yǒu)必要(yào)了(le)解色譜數(shù✔>φ)據處理(lǐ)程序是(shì)如(rú¶β)何進行(xíng)積分(fēn)的(de)。這(zhè)裡(lǐ¥ Ω)将嘗試討(tǎo)論一(yī)個(gè)通(tō₽§β♣ng)用(yòng)的(de)過程，不(bù)同的(de)色譜數(shù)據處★↓"理(lǐ)系統可(kě)能(néng)在★ 細節上(shàng)有(yǒu)所不(bù)同。

色譜積分(fēn)過程包括下(xià)列事(sβ"σhì)件(jiàn)：

  • 确定初始基線

首先取第一(yī)數(shù)據點作(zuò)為(wèi₩§​)一(yī)個(gè)暫定基線點。然後積分(fēn)器(qì)取↔∞$一(yī)定數(shù)據點的(de)平均值重新定義♣ €≈初始基線點。用(yòng)作(zuò)取平均值的(de)數(shù)據點數(∑γ ♥shù)是(shì)由峰寬函數(shù)決定的(de)。在确立了(le)₩☆‌≠的(de)新的(de)基線點前，第一(yī)數(shù)據點被取作(zuò)•<α初始基線點。

  • 連續追蹤和(hé)更新基線

随著(zhe)積分(fēn)器(qì)不(bù)斷錄βδ€♦入新的(de)數(shù)據點，基線點需要(yào)向後推移♠"‍ 并更新。被接納為(wèi)基準點，一(yī)個(gè)數(shù)據點必須σ‍符合以下(xià)條件(jiàn)：

  • 它必須在所指定的(de)由斜率阈值決定的(de)基線阈值內(n↔→δèi)

  • 基線的(de)曲率必須低(dī)于由斜率阈值☆™‍§确定的(de)阈值

  • 累積總和(hé)不(bù)能(néng)超過指定的(de)面積阈值©>

基線以由峰寬值決定的(de)速率不(bù)斷重置，直到(dào)檢測出色 ÷®譜峰。

  • 色譜峰開(kāi)始時(shí)間(jiān)的(de)識别和(h→♠é)确認

當新錄入的(de)數(shù)據點超出基線阈值，并且基線曲率超過由斜率靈敏度Ω∏≠♦函數(shù)确定的(de)設定值，即辨别出一(yī)個(gè)潛在₹₩的(de)色譜峰。如(rú)果接下(xià)來(∏∑lái)的(de)數(shù)據點保持上(shàng)升，并滿足下÷♦ φ(xià)列條件(jiàn)，積分(fēn)器(qì)即識别出一(y±±ī)個(gè)潛在的(de)色譜峰開(kāi)始時(s∑εhí)間(jiān)。

  • 斜率和(hé)曲率超過由基線阈值确定的(de)限值λ™ 

  • 連續的(de)數(shù)據點之間(jiān)的(dδ↕e)差值超過噪聲阈值

潛在的(de)色譜峰開(kāi)始時(s₽ ☆hí)間(jiān)被确認的(de)條件(jiàn)需要(yào)符合下(•±•xià)列标準：

  • 斜率繼續超過由基線阈值确定的(de)限制(↔¥zhì)

  • 累計(jì)面積超出峰面積阈值

  • 曲率變為(wèi)負值形成前拐點

  • 色譜峰頂點的(de)确認

峰頂點的(de)确認需要(yào)滿足下(x≈×¥§ià)列條件(jiàn)：

  • 斜率通(tōng)過零點并變為(wèi)負值

  • 曲率變為(wèi)正值

  • 後續數(shù)據點的(de)值降低(dī)，且該數(shù) ±據點與後續3個(gè)數(shù)據點的(d∏♦e)峰面積差累計(jì)超過2/3的(de)峰面積阈值。

  • 色譜峰終點的(de)識别和(hé)确認

色譜峰潛在終點的(de)識别條件(jiàn)：

  • 斜率和(hé)曲率回落到(dào)由基線阈值确定的(de)限值✘&內(nèi)

  • 兩個(gè)連續的(de)數(shù)據點之間(jiān)的♣‌±(de)差值小(xiǎo)于5倍噪聲阈值

  • 色譜峰終點的(de)确認條件(jiàn)：

  • 斜率和(hé)曲率保持在基線阈值确定的(de)限值內(nèi)

  • 在方法建立過程中，依據不(bù)同參數(shù)對(duì)色譜積分(fα₹©¥ēn)事(shì)件(jiàn)的(de)作(£₩¥↓zuò)用(yòng)進行(xíng)各參數(sβπ₽εhù)（斜率靈敏度，噪聲阈值，峰寬阈值，峰面積的(de)阈值，峰高(gāo)阈 ♥​✔值等）的(de)設定。

3.2 未完全分(fēn)離(lí)色譜峰

對(duì)于色譜峰的(de)最準确的(de)積分(fēn)要(yà♦↕φ∞o)求所有(yǒu)的(de)峰完全分(fēn£®♦)離(lí)。如(rú)有(yǒu)某些(xiē)需要(yào)精σβ 确定量測定的(de)峰沒有(yǒu)完全分(fēn)離(lí)，首先需要(y•βγ£ào)優化(huà)色譜分(fēn)離(lí)條件(jiàn)。在經&₽>過大(dà)量努力後還(hái)是(shìΩ↔φ>)不(bù)能(néng)獲得(de)充分(fēn)分(f£λ↔ēn)離(lí)的(de)情況下(xià)，可(kě)以考慮通≠↓∑←(tōng)過合理(lǐ)的(de)積分(fēn)獲取未分(fēn)離(‌¶♦>lí)組分(fēn)相(xiàng)對(d↕→✘uì)的(de)準确峰面積。

如(rú)果定量數(shù)據必須從(có↕±≈ng)未分(fēn)離(lí)峰獲得(de≈±¶↑)，需要(yào)制(zhì)定明(mí£₽ng)确的(de)規定，以便确定未分(fēn)離₩ (lí)峰應該如(rú)何積分(fēn)。™π​®這(zhè)樣的(de)規定應該包含在什(shén)麽情況下(xià)可(↓λkě)以使用(yòng)什(shén)麽功能(né±∏ng)對(duì)未分(fēn)離(lí)色譜峰進₽♦行(xíng)積分(fēn)，這(zhè)些₩ε(xiē)功能(néng)包括：

  • 切線撇去(qù)

  • 指數(shù)撇去(qù)

  • 指數(shù)曲線拟合

  • 直線撇去(qù)

  • 前伸峰撇去(qù)

  • 拖尾峰撇去(qù)

  • 峰谷比

  • 谷高(gāo)比

  • 谷垂直切分(fēn)

3.3 積分(fēn)效果的(de)基本要(yào)求

進行(xíng)合理(lǐ)合規的(de)積分(•& ±fēn)需要(yào)明(míng)确怎樣才算(suàn)是(shì)适當& 和(hé)準确的(de)積分(fēn)。筆(bΩ$ǐ)者認為(wèi)原則性的(de)标準應該是(shì)“不(bù)多§™π★(duō)不(bù)少(shǎo)”地(dì)積分(fēn♠§)。

為(wèi)使同一(yī)實驗室內(nèiδ$φ∑)不(bù)同分(fēn)析人(rén)員(yuán)有(yǒu)一(₽∞€yī)個(gè)統一(yī)的(de)标準，建議(yì)在書(shū)面文(w☆✔'én)檔中用(yòng)圖表來(lái)說(shuō)明(m←♠•íng)什(shén)麽是(shì)可(kě)接受的(de)ε&±色譜峰，什(shén)麽是(shì)不(bù)可(β≤ kě)接受的(de)色譜峰。如(rú)圖2，其中峰A表示可(kě)接受§§的(de)積分(fēn)峰；而峰B是(shì)不(bù)可(kěε•)接受的(de)峰積分(fēn)，因為(wèi)峰的(de)拖尾部×±ε分(fēn)未被完全積入； 峰C也(yě)是(≠ ♠σshì)不(bù)可(kě)接受的(de)，因為(wèi)将可(kě)能(n¥ ↕éng)是(shì)基線漂移的(de)區(qū)域積進去(q♦$ù)了(le)。

3.4 積分(fēn)參數(shù)的(de)設定♠✘和(hé)驗證

在做(zuò)主成分(fēn)測定時(shí)，數(shù)≤ε ♠據處理(lǐ)方法的(de)控制(zhì)相(xiàng)對(duì)★∑γ容易。但(dàn)是(shì)當涉及到(d¥<♣'ào)有(yǒu)關物(wù)質測定時(shí)，數(shù)←λ±φ據處理(lǐ)方法的(de)開(kāi)發和(hé)控制(€§÷zhì)有(yǒu)時(shí)候是(shì)非常具有(yǒu)挑戰性©≈≥的(de)。建議(yì)在方法學的(de)準确度和(hé<♥±β)精密度驗證部分(fēn)，專門(mén)考察改變積分(fēn)參數(sh♥±ù)對(duì)最終結果的(de)影(yǐng)響。可(kě)以×→↓‍使用(yòng)在回收率實驗中獲得(de)的(de)原始α"數(shù)據，對(duì)下(xià)面的(de)®®>主要(yào)積分(fēn)參數(shù)進行π‌↔≈(xíng)系統化(huà)地(dì)測試（不(bù)同的∞​(de)數(shù)據處理(lǐ)軟件(jiàn)可(kě♦↑Ω&)能(néng)有(yǒu)不(bù)同的(de)參數(♦ ≤¶shù)）：

• 斜率靈敏度

• 峰寬阈值

• 峰高(gāo)阈值

• 面積阈值

• 噪聲阈值

記錄并評估這(zhè)些(xiē)參數(shù)的(de✔ε)改變對(duì)回收率計(jì)算(suàn)結果的(de)影(yǐng)​σ'Ω響，并在滿足回收率标準（通(tōng)用(yòng)§β★¥标準為(wèi)98.0~102.0%）的(d×∞e)參數(shù)組合中選擇居中的(de)參數(shù)組合，以便獲得(dΩδe)更好(hǎo)的(de)方法耐用(yòn≥&•$g)性。後續出現(xiàn)分(fēn)析結‌©λ果異常（如(rú)出現(xiàn)新的(de)未知(↕'"zhī)雜(zá)質）需要(yào)重新設定積分(fē♠∏n)參數(shù)時(shí)，這(zhè)些(xiē)對©λ(duì)參數(shù)改變的(de)研究數(s‌✘✔hù)據，也(yě)可(kě)以為(wèi)參數(shù)的(de₩₹®)可(kě)修改範圍提供依據。

3.5 特殊情況下(xià)積分(fēn​↓ε)參數(shù)的(de)重新設定和(hé)驗證

分(fēn)析人(rén)員(yuán)有(yǒu)時(shí)候會(huì)>☆←遇到(dào)一(yī)些(xiē)特殊情況。比如(rú)，一(yī)個(g ₹•è)通(tōng)過驗證的(de)方法，在常規分(fēn)析時(shí)​​完全沒有(yǒu)問(wèn)題，但(dàγεπ&n)在穩定性測試期間(jiān)，有(yǒu)時↑∑₩(shí)候後會(huì)有(yǒu)新的(de)色譜峰、峰型改變、共洗脫峰><等異常情況，這(zhè)種情況下(xià)往往原來(lái)的(d₹•e)分(fēn)析方法不(bù)再适用(yòng)。

如(rú)果是(shì)已上(shàng)市(shì)藥品出>✔↑現(xiàn)了(le)上(shàng)述異常情況，表示↕≠÷α這(zhè)些(xiē)産品可(kě)能(néngΩ∏)不(bù)符合規範，并應啓動實驗室和(hé)生(≈Ωδshēng)産調查，以表征雜(zá)質，并确定其來(lái&≠≥)源。這(zhè)種情況一(yī)旦經過确認，企業(yè)需要(y÷•αào)從(cóng)市(shì)場(chǎ☆₩γng)上(shàng)召回産品，因為(wèi)一(yī)個(gè)✔™£ 産品降解特性的(de)鑒定是(shì)銷售許可(kě)的(de•✔©π)先決條件(jiàn)。

在另一(yī)方面，如(rú)果異常情況出現(xiàn)在>→≤±産品開(kāi)發的(de)早期階段，同樣需要(yào₩∑)表征雜(zá)質和(hé)确定其來(lái)源。這π$≈λ(zhè)時(shí)候分(fēn)析人(rén)員(£αyuán)可(kě)能(néng)需要(yà≥δ₹≈o)修改數(shù)據處理(lǐ)方法或者整個(gè)分(f≥φ→±ēn)析方法并重新驗證。這(zhè)種情況在藥物(wù)研發的(de)早期&₽階段經常發生(shēng)，可(kě)以說(shuō)分(fēn)♠≈<析方法驗證應被視(shì)為(wèi)一(yī)個(gè)過程，而非•∞一(yī)次性的(de)工(gōng)作(zu★" ò)。

4 結論意見(jiàn)

色譜峰的(de)積分(fēn)是(shì)在現(xiàn)代分(fē€≥n)析實驗室中最經常執行(xíng)的(de)活 <動之一(yī)。為(wèi)了(le)獲得(de)一(yī)緻的(de)結果≈∑♣，每次分(fēn)析數(shù)據的(de)積分(fēn)都(dōu)需要(←‌yào)使用(yòng)相(xiàng)同♠‌的(de)方式。正是(shì)出于這(zhè)個(gè)原因，我們建議(y₽↕£ ì)實驗室建立适當的(de)規範和(hé)标準操→✔¥"作(zuò)程序，為(wèi)準确和(hé)科(kē)學的(de)積分(fēnε✔≠ )提供明(míng)确的(de)依據。

此外(wài)，應該建立明(míng)确的(de∏∏ ↔)程序，規範方法開(kāi)發和(hé)驗證階段"♣←的(de)積分(fēn)參數(shù)選擇和(hé)驗證。而經核準的(de)書σ¥(shū)面方法應該包括合适的(de)色譜積分(fēn)參數(shù)，并★φ✔指定允許分(fēn)析人(rén)員(yu©‌án)在必要(yào)的(de)異常情況下(xià)作(zuò≤♥)出适當調整的(de)範圍。一(yī)個(gè)γσ方法一(yī)旦經過驗證且被使用(yòng)，之後對(duì)每個(gè)γ₹‍©色譜數(shù)據的(de)積分(fēn)都(d§∏ōu)需要(yào)用(yòng)這(zhè)&✘‍ 個(gè)方法以确保使用(yòng)相(xiàng)同的(de)€♣↑$參數(shù)。而出現(xiàn)異常情況對(duσ‌ì)方法做(zuò)出調整後，需要(yà¶ o)重新驗證并對(duì)異常事(shì)件(jiàn) λ®‌根源進行(xíng)調查和(hé)合理(l∏€αφǐ)的(de)解釋。