規範環境下(xià)色譜積分(fēn)的(de)合理(lǐ)合規♣•性控制(zhì)

為(wèi)确保對(duì)色譜峰進行(xíng)正确的(de)測量（或≈£♥積分(fēn)），需要(yào)分(fēn)析人(₩γrén)員(yuán)對(duì)積分(fēnα♦')結果進行(xíng)準确性和(hé)一(yī)緻性判斷。在"♣¶ 大(dà)多(duō)數(shù)情況下(xià)，人(rén)為(wèi)參×≈↑與的(de)過程往往會(huì)導緻判斷結果受到(dào)非客觀标準的(de)★ ♦∞影(yǐng)響。所以色譜積分(fēn)★α的(de)合理(lǐ)合規性尤為(wèi)重要(yào)，這(zhè)也(y✘'λ'ě)是(shì)監管機(jī)構的(de)審查αφ 重點，這(zhè)篇文(wén)章(zhāng)我們将簡要(yào)討(tǎ¶λ∑o)論如(rú)何對(duì)色譜積分(fēn♠££♠)進行(xíng)合理(lǐ)合規性控制(zhì)。

1 簡介

高(gāo)效液相(xiàng)色譜（HPLC）和(hé)氣相(xiàng)色€•譜（GC）是(shì)現(xiàn)代分(fēn)析實驗室中最常用(←∑©yòng)的(de)技(jì)術(shù)。這(zhè<¶✔)兩種技(jì)術(shù)的(de)專屬性、靈敏度和π&(hé)靈活性使其适用(yòng)于廣泛的(de)樣品基質中絕大(d₽"$à)多(duō)數(shù)被分(fēn)析物(wù)的(de)測定。₽₹ 這(zhè)兩種技(jì)術(shù)的(de)€♥✔原始輸出都(dōu)是(shì)信号強度對(d≠δuì)比時(shí)間(jiān)的(d© ↓φe)曲線圖，通(tōng)常稱為(wèi)色譜圖δ₩‌。色譜圖中的(de)各個(gè)峰分(fēn)别對(du∑£ €ì)應于樣品中的(de)各個(gè)成分(fēn)，♦∏γ€而峰面積通(tōng)常正比于樣品中相(xiàn¥∞"g)應成分(fēn)的(de)濃度。

要(yào)定量樣品中的(de)被分(fēn)ε✘析物(wù)濃度，就(jiù)需要(yào)對(duì)€↑₽ε色譜圖進行(xíng)積分(fēn)以測量峰的(•↔de)面積。現(xiàn)代高(gāo)π×效液相(xiàng)色譜法和(hé)氣相(xiàng)色譜儀配備的(de)電(ε≥Ω•diàn)腦(nǎo)色譜數(shù)據采集和(hé)處理‌¥(lǐ)系統，都(dōu)具備自(zì)動化(huà)積分(fēn)的(d$‌ ♠e)功能(néng)，分(fēn)析人(rén)員(yuán)需≥≥¥要(yào)做(zuò)的(de)主要(yào)是(shì)設定适當的∑☆(de)積分(fēn)參數(shù)（例如(rú)：斜率靈敏☆₩"‌度，噪聲阈值，峰寬阈值，峰面積的(de)阈值★∏©，峰高(gāo)阈值，撇去(qù)率等），軟件(jiàn)将依據這(zhè§∏₽)些(xiē)參數(shù)來(lái)對(duì♦ε∞)各個(gè)色譜峰進行(xíng)确認和(hé)積分(f✔ '↑ēn)。

2 監管要(yào)求

由于分(fēn)析人(rén)員(yuán☆ )可(kě)以根據自(zì)己的(de)主觀判斷人(rén)為(≠∞wèi)地(dì)設定積分(fēn)參數(shù)，無論在常規審查或藥>γ品生(shēng)産上(shàng)市(shì)授權β©©評估過程中，對(duì)色譜峰正确和(hé)精确的(de)積分(fēn)及其過♠™程都(dōu)是(shì)重點審核內(nè>πi)容。

從(cóng)美(měi)國(guó)FD>¶♦↔A對(duì)藥企發布的(de)警告信中，可(kě)以看(kàπ₩n)到(dào)關于色譜積分(fēn)的(de♦π®)一(yī)些(xiē)更加具體(tǐ)化(huà)的(de)要(yào) ♠<求：

• 不(bù)允許采用(yòng)手動積分(ε§fēn)。

• 需要(yào)開(kāi)啓色譜軟件(jiàn)的(d§♦Ωe)審計(jì)跟蹤功能(néng)，并将包含積分(fēn)參數(shù)​ α的(de)分(fēn)析方法和(hé)原始數(shù)據一( £™yī)同保存，以确保方法的(de)積分($♠±fēn)參數(shù)修改曆史可(kě)追溯。

• “更改積分(fēn)參數(shù)，以得(de)到(dà‍←"®o)好(hǎo)的(de)積分(fēn)結果”是(shì)不(bù)可<∑(kě)接受的(de)。在審查過程中，沒有(yǒu★‌)合理(lǐ)解釋的(de)多(duō)次重新積分(fēn)被認為(wèi)是π≥(shì)企圖人(rén)為(wèi)操縱峰面積以γ∑獲得(de)合格的(de)結果。

• 方法一(yī)旦經過驗證且被用(yòng)于藥品的(♦∑✘ de)常規QC放(fàng)行(xíng)，對(duì)φα©☆後續每個(gè)色譜數(shù)據的(de)積分(fēn)都(dōu)₹πλ→需要(yào)使用(yòng)該方法以确保一§ (yī)緻性。FDA當前的(de)期望實際上(shàng)是('™Ωshì)傾向于将色譜方法“鎖定”以保證始終使用(yòng)同樣的(de↓• ✔)積分(fēn)參數(shù)。

綜合來(lái)講，色譜峰的(de)積分(fēn)、積分(fēn)參數(sh'≥✔✔ù)的(de)設定和(hé)驗證、積分(fēn)參數(shù)±$σ的(de)修改和(hé)再驗證等都(dōu)要(yào‍₽)遵循科(kē)學合理(lǐ)的(de)過程，并通(tōng)過标準↑←¥操作(zuò)規程（SOP）或類似的(de)文(w‌↓én)件(jiàn)進行(xíng)控制(zhì)。

3 控制(zhì)色譜積分(fēn)的(de)合理(lǐ)合規性

那(nà)麽，要(yào)怎樣控制(zhì)色譜積分(™ ≤fēn)的(de)合理(lǐ)合規性呢(ne)？我們分(fēn)以下(x€♠ià)幾個(gè)小(xiǎo)節來(lái)探討(tǎo)。

3.1 通(tōng)用(yòng)積分(fēn)過程及參數(shùδ​)

為(wèi)了(le)對(duì)積分(fēn)參數(sh​≥α★ù)進行(xíng)設定，有(yǒu)必要(yào)了(le)<¶∞解色譜數(shù)據處理(lǐ)程序是(shì)如(rú)何進行(¶φ₽xíng)積分(fēn)的(de)。這(zhè)裡(lǐ®÷)将嘗試討(tǎo)論一(yī)個(gè)通(tōng)用(yòng)的(d π♦e)過程，不(bù)同的(de)色譜數(shù)據處¥δ& 理(lǐ)系統可(kě)能(néng)在細節上(shàng)有(yǒu)所βε不(bù)同。

色譜積分(fēn)過程包括下(xià)列πΩ事(shì)件(jiàn)：

  • 确定初始基線

首先取第一(yī)數(shù)據點作(zuò♣•)為(wèi)一(yī)個(gè)暫定基線點。然後積分(fē© n)器(qì)取一(yī)定數(shù)據點的(de↑π)平均值重新定義初始基線點。用(yòng)作(zuò)取平均值的(∏÷≥₹de)數(shù)據點數(shù)是(shì)由峰寬函數(shù)決定的(de→&)。在确立了(le)的(de)新的(de)基線點前，第一(yī)數(shù)$π₹∞據點被取作(zuò)初始基線點。

  • 連續追蹤和(hé)更新基線

随著(zhe)積分(fēn)器(qì)不(bù)斷↔₽ 錄入新的(de)數(shù)據點，基線點需要(yào)向後推移并更新。被πγ ≤接納為(wèi)基準點，一(yī)個(gè)數(shù)據點必須符合 ≥以下(xià)條件(jiàn)：

  • 它必須在所指定的(de)由斜率阈值決定的(de)基線阈值內(nèi∏±Ω)

  • 基線的(de)曲率必須低(dī)于由斜率阈‌Ω值确定的(de)阈值

  • 累積總和(hé)不(bù)能(néng)超過指定的(de)面&&₹¶積阈值

基線以由峰寬值決定的(de)速率不(bù)斷重置，直到(dà↑γ∏o)檢測出色譜峰。

  • 色譜峰開(kāi)始時(shí)間(jiān✘±)的(de)識别和(hé)确認

當新錄入的(de)數(shù)據點超出基線阈值，并且基線曲率超過由斜率Ωπβ靈敏度函數(shù)确定的(de)設定值，即辨别出一(yī)個(gè)&&€潛在的(de)色譜峰。如(rú)果接下(x♠'♠ià)來(lái)的(de)數(shù)據點保持上(shàng)升，α&Ω并滿足下(xià)列條件(jiàn)，積分(fēn)器​$(qì)即識别出一(yī)個(gè)潛在的(de)色譜峰開(kāi)始時(sφ←↓∞hí)間(jiān)。

  • 斜率和(hé)曲率超過由基線阈值确定的(de)限值

  • 連續的(de)數(shù)據點之間(jiān)的(de)差值超過噪聲阈值

潛在的(de)色譜峰開(kāi)始時(shí)間"‌ &(jiān)被确認的(de)條件(jiàn)需 $要(yào)符合下(xià)列标準：

  • 斜率繼續超過由基線阈值确定的(de)限制(zhì)

  • 累計(jì)面積超出峰面積阈值

  • 曲率變為(wèi)負值形成前拐點

  • 色譜峰頂點的(de)确認

峰頂點的(de)确認需要(yào)滿足下(xià)列條件$∞✔✔(jiàn)：

  • 斜率通(tōng)過零點并變為(wèi)負值

  • 曲率變為(wèi)正值

  • 後續數(shù)據點的(de)值降低(dī)，且該數(shù)據點§γ&∏與後續3個(gè)數(shù)據點的(de)峰面積差累計Ω ♦"(jì)超過2/3的(de)峰面積阈值。

  • 色譜峰終點的(de)識别和(hé)确認

色譜峰潛在終點的(de)識别條件(jiàn)：

  • 斜率和(hé)曲率回落到(dào)由基線阈值确定的(d¶¥e)限值內(nèi)

  • 兩個(gè)連續的(de)數(shù)據點之間§ ₽​(jiān)的(de)差值小(xiǎo)于5倍噪≥↓÷₩聲阈值

  • 色譜峰終點的(de)确認條件(jiàn)：

  • 斜率和(hé)曲率保持在基線阈值确定的(de)限值內(nèi)

  • 在方法建立過程中，依據不(bù)同參數(s λ ∞hù)對(duì)色譜積分(fēn)事(←≤♣₩shì)件(jiàn)的(de)作(zuò)用(yòn₽ ♦g)進行(xíng)各參數(shù)（斜率靈敏度，噪聲阈值，峰寬阈值，峰₩♦≥↑面積的(de)阈值，峰高(gāo)阈值等）的(de)設定₩≥×。

3.2 未完全分(fēn)離(lí)色譜¶ ♣​峰

對(duì)于色譜峰的(de)最準确的(de)積分(fēn↓∏¶)要(yào)求所有(yǒu)的(de)峰完全分(fēn)離(l↕φ§​í)。如(rú)有(yǒu)某些(xiē)需要(yào)精确定量測定的(de)α¥γ£峰沒有(yǒu)完全分(fēn)離(lí)，首先需要(yà∑©o)優化(huà)色譜分(fēn)離(lí)條件(jiàn)。在經過大φ<(dà)量努力後還(hái)是(shì)不(bù)能(néng←σπ )獲得(de)充分(fēn)分(fēn)離(lí)的(d✘δe)情況下(xià)，可(kě)以考慮通(tōng)過合理(lǐ‍ )的(de)積分(fēn)獲取未分(fēn)離(lí)♣∏$§組分(fēn)相(xiàng)對(duì)的(de)準确峰面積±↓♥。

如(rú)果定量數(shù)據必須從(cóng)未分(fēn)離(lα×↔>í)峰獲得(de)，需要(yào)制(zhì)定明(míng)确的(de∏☆')規定，以便确定未分(fēn)離(lí)峰應該如(rú)何積分(fēn)。♣φ這(zhè)樣的(de)規定應該包含在什(shén)麽情況下(xià♠γ)可(kě)以使用(yòng)什(shén)麽功能(néng σ)對(duì)未分(fēn)離(lí)色譜峰進行(xíng)積分(f <ēn)，這(zhè)些(xiē)功能(néng)包括：

  • 切線撇去(qù)

  • 指數(shù)撇去(qù)

  • 指數(shù)曲線拟合

  • 直線撇去(qù)

  • 前伸峰撇去(qù)

  • 拖尾峰撇去(qù)

  • 峰谷比

  • 谷高(gāo)比

  • 谷垂直切分(fēn)

3.3 積分(fēn)效果的(de)基本要(yào)求

進行(xíng)合理(lǐ)合規的(de)積分(fēnφ¥)需要(yào)明(míng)确怎樣才算(suàn)是(s±↕≈☆hì)适當和(hé)準确的(de)積分(fēn)。筆(bǐ)者認為(wèi)原≠<則性的(de)标準應該是(shì)“不(bù÷↔)多(duō)不(bù)少(shǎo)”地(&≈dì)積分(fēn)。

為(wèi)使同一(yī)實驗室內(nèi)不Ω¶§(bù)同分(fēn)析人(rén)員(yuán)有(£☆"yǒu)一(yī)個(gè)統一(yī)的(de)标準，建議(y₩→εεì)在書(shū)面文(wén)檔中用(€♥δyòng)圖表來(lái)說(shuō)明(míng)什(sh←≥én)麽是(shì)可(kě)接受的(de)色譜峰 λ↓，什(shén)麽是(shì)不(bù)可Ω¶↓(kě)接受的(de)色譜峰。如(rú)圖2，其中峰A表示可(kěε‌$)接受的(de)積分(fēn)峰；而峰B是(shì)不(bù)可(kě)接受' Ω的(de)峰積分(fēn)，因為(wèi)峰的(de)≠↕★™拖尾部分(fēn)未被完全積入； 峰C也(yě)是(s≥₩↑≥hì)不(bù)可(kě)接受的(de)，因為(wΩλ₹èi)将可(kě)能(néng)是(shì)基線漂移的(de)&"區(qū)域積進去(qù)了(le)。

3.4 積分(fēn)參數(shù)的(de)設'§ ®定和(hé)驗證

在做(zuò)主成分(fēn)測定時(sh≠★í)，數(shù)據處理(lǐ)方法的(de)控制(zhì)相(xi∏®àng)對(duì)容易。但(dàn)是(shì)當涉及到(≥±✘$dào)有(yǒu)關物(wù)質測定時(shí)，數(shù)據處理¶£(lǐ)方法的(de)開(kāi)發和(hé≥≤♦)控制(zhì)有(yǒu)時(shí)候是(shì)非常具有(yǒu)π∞挑戰性的(de)。建議(yì)在方法學的(de)準确度和(←ε✔hé)精密度驗證部分(fēn)，專門(mén)考察改變積分≠ §(fēn)參數(shù)對(duì)最終結果的(de)影(yǐn×​↔g)響。可(kě)以使用(yòng)在回收率實驗中獲得(de)的(de)原δ∑¶≈始數(shù)據，對(duì)下(xià)面的(de)主要☆ε®↔(yào)積分(fēn)參數(shù)進行(xíng)系統 ↔↔化(huà)地(dì)測試（不(bù)同的(de)數(shù)據處理(lǐ)™∏✘軟件(jiàn)可(kě)能(néng)有(♠ φyǒu)不(bù)同的(de)參數(shù)）：

• 斜率靈敏度

• 峰寬阈值

• 峰高(gāo)阈值

• 面積阈值

• 噪聲阈值

記錄并評估這(zhè)些(xiē)參數(shù)的(de)改變對(duì)‌"↓回收率計(jì)算(suàn)結果的(de)影(yǐng)響，并♥←在滿足回收率标準（通(tōng)用(yòng)标準為(wèi)98δσ•♠.0~102.0%）的(de)參數(sh♣∏φù)組合中選擇居中的(de)參數(shù)組♦∏合，以便獲得(de)更好(hǎo)的(de☆↓♠)方法耐用(yòng)性。後續出現(xi☆±≈àn)分(fēn)析結果異常（如(rú)出現(xiàn)新的(d✘→&‌e)未知(zhī)雜(zá)質）需要(yào)重新設定積分(f♥ ēn)參數(shù)時(shí)，這(zhè®'★≤)些(xiē)對(duì)參數(shù)改變的(de)研​φ<究數(shù)據，也(yě)可(kě)以為(wèi)參數(shù)的(β♣<de)可(kě)修改範圍提供依據。

3.5 特殊情況下(xià)積分(fēn)參數(shù)∞‍的(de)重新設定和(hé)驗證

分(fēn)析人(rén)員(yuán)有(yǒu)∞>時(shí)候會(huì)遇到(dào)一(♠‌‍♦yī)些(xiē)特殊情況。比如(rú)，一÷•≤Ω(yī)個(gè)通(tōng)過驗證的(de)方法，在常規分(fē↑σ↔n)析時(shí)完全沒有(yǒu)問(wèn)題，但(dànΩ ¶)在穩定性測試期間(jiān)，有(yǒu)時(shí)候後會(h∏¶™₽uì)有(yǒu)新的(de)色譜峰、峰型改變、共洗脫峰等異常情況，這(zh∏λè)種情況下(xià)往往原來(lái)的(de)分(fēn₹∞↑♥)析方法不(bù)再适用(yòng)。

如(rú)果是(shì)已上(shàng✘ ε)市(shì)藥品出現(xiàn)了(le)上(shàng)↓∏★÷述異常情況，表示這(zhè)些(xiē)産品可(kě)Ω↕λ♥能(néng)不(bù)符合規範，并應啓動實驗α®Ωα室和(hé)生(shēng)産調查，以表征雜(zá)質，并确定其來(lá←β€i)源。這(zhè)種情況一(yī)旦經過确認，企業(yè)需要(yào)© 從(cóng)市(shì)場(chǎng)上(shàng)召回産品± ，因為(wèi)一(yī)個(gè)産品降解特性的(d✘÷β≤e)鑒定是(shì)銷售許可(kě)的(de)先決條件(ji÷↓Ωàn)。

在另一(yī)方面，如(rú)果異常情況出現(xiàn)在産品開(kāi₽£)發的(de)早期階段，同樣需要(yào)表征雜(zá)質和(héו)确定其來(lái)源。這(zhè)時(shí)候分(fēn)析人(rén)Ω•員(yuán)可(kě)能(néng)需要(yào)修改數(shù)據ε≥σ處理(lǐ)方法或者整個(gè)分(fēn)析方法α±≠±并重新驗證。這(zhè)種情況在藥物(wù≠♦)研發的(de)早期階段經常發生(shēng)，可(kě)以說 ₹(shuō)分(fēn)析方法驗證應被視(shì)為(wèi)一(yλ≈σ↑ī)個(gè)過程，而非一(yī)次性的(de)工(gōng)作(z₽∑ uò)。

4 結論意見(jiàn)

色譜峰的(de)積分(fēn)是(shì)↔ δ&在現(xiàn)代分(fēn)析實驗室中最經常執行(xíng)的(♠¶de)活動之一(yī)。為(wèi)了(le)獲得(de)一↑£"(yī)緻的(de)結果，每次分(fēn)析數ΩΩ(shù)據的(de)積分(fēn)都(dōu)需要(yào)使用(y®±&òng)相(xiàng)同的(de)方式★©ε‌。正是(shì)出于這(zhè)個(gè)原 ®因，我們建議(yì)實驗室建立适當的(de)規範和(hé)标準操作(zuò)程πλΩ序，為(wèi)準确和(hé)科(kē)學的(de) π∏積分(fēn)提供明(míng)确的(de)依據。•‍

此外(wài)，應該建立明(míng)确的(de)程序，規範方法開§β(kāi)發和(hé)驗證階段的(de)積分(fēn)↔♣​參數(shù)選擇和(hé)驗證。而經核準的(de)書(shū)面π©方法應該包括合适的(de)色譜積分(fēn)參數(shù)，并↓<€指定允許分(fēn)析人(rén)員(yuá₹÷₩n)在必要(yào)的(de)異常情況下(xià)作(zu∞ ò)出适當調整的(de)範圍。一(yī)個(gè)方法一(Ωβyī)旦經過驗證且被使用(yòng)，之後對(duì)每個(gè)色譜數(↑±÷¶shù)據的(de)積分(fēn)都(dōu)需要(yàα×<€o)用(yòng)這(zhè)個(gè)方法> ♠以确保使用(yòng)相(xiàng)同的(de)參數(shù)。而出∑♣現(xiàn)異常情況對(duì)方法做✘ ☆(zuò)出調整後，需要(yào)重新驗證并對(duì)異常事(sφ‍ ↔hì)件(jiàn)根源進行(xíng)調查和(hé)合$>÷§理(lǐ)的(de)解釋。